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细胞术检测文件资料翻译 |
重组真核表达载体转染COS-7细胞：tip100大规模抽提质粒； DMEM培养基（含10%小牛血清）、5%CO2、37℃培养COS-7细胞，待孔板内的细胞生长融合度达90%左右时，参考脂质体Lipofectamine 2000说明书进行转染实验。转染24-48 h后收获细胞用于相应实验。
RT-PCR法检测αⅡbA477P（A446P）mRNA表达 相应质粒转染COS-7细胞24小时后抽提RNA，以P2和P4为引物，βactin引物为内参照，进行RT-PCR扩增,并以未经RT的RNA为模版，P2和P4为引物进行PCR扩增，作为阴性对照。
Western-blot法检测αⅡbA477P（A446P）蛋白质的表达:样品处理：取含80ul含50ug总蛋白的COS-7转染24小时后细胞（携带正常αⅡbβ3基因和突变αⅡbA477P（A446P）β3基因）分别与20ul 5× SDS sample buffer混匀后于100 ℃的水浴煮沸10分钟，同时取正常人血小板裂解物为对照；将样品加入上样孔中，以150 V 恒压电泳；蛋白转膜( 120V, 2 h)后将PVDF膜置封闭液(3%BSA + 50 g/L脱脂牛奶, PBS稀释)中封闭2 h后,加入1：3000稀释的PMI-1(αⅡb单克隆抗体)室温孵育2 h;洗涤后加入1∶10000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG ,室温振荡孵育2h；清洗后采用化学发光法检测：混合1 ml ECL( enhanced chemi2luminenscene) 溶液A和25 μl溶液B，覆于膜上反应5 min，暗室曝光X线底片。
流式细胞术检测αⅡbβ3在COS-7细胞膜表面的表达：转染后48小时细胞洗涤3次；用PBS稀释至约1 × 105细胞/ml；加入15ul FITC-anti-CD41 单抗，混匀后室温避光反应30分钟；洗涤2次后加入1滴PBS缓冲液，再加入200ul 1%多聚甲醛后上机检测。
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